NAM4toxins - The use of nucleic acid mimics in aptamers technology for the detection of foodborne toxins

Objetivo principal 

Atualmente, a deteção de toxinas de origem alimentar baseia-se em técnicas analíticas complexas e demoradas, ou em testes imunológicos, com limitações associadas ao desempenho dos anticorpos. Aptâmeros são sequências de ácidos nucleicos de cadeia simples que possuem características únicas de ligação às moléculas-alvo. A sua seleção é, tipicamente, limitada a ácidos nucleicos naturais (DNA ou RNA), restringindo a 4 nucleótidos o número de combinações possíveis para cada posição. A utilização de mímicos de ácido nucleico (NAMs), moléculas sintéticas com variadas estruturas capazes de hibridar com sequências complementares de DNA/RNA, permite aumentar as possíveis combinações, aumentando exponencialmente o número de potenciais aptâmeros. O principal objetivo deste projeto é aplicar uma nova metodologia de seleção de aptâmeros, baseada na síntese de novo de uma biblioteca de sequências compostas por NAMs e num único passo selecionar aptâmeros específicos para toxinas alimentares. Esta abordagem permitirá criar uma plataforma para o desenvolvimento de novos aptâmeros que combina a capacidade de reconhecimento destes com a diversidade dos NAMs. Como caso de estudo, este projeto incidirá sobre as enterotoxinas de Staphylococcus (SE), mas pode ser facilmente adaptado a outras toxinas.

Atividades:

O plano de trabalhos proposto prevê a execução de 4 atividades de caracter científico que se articulam entre duas entidades: INIAV e FEUP.

• Atividade 1 – Seleção in vitro de NAM-aptâmeros. Será gerada uma pool de aptâmeros que incorporem NAM e estes serão sujeitos a um processo de seleção e purificação sequencial. No final, os aptâmeros mais promissores serão selecionados para a tarefa seguinte.

• Atividade 2 – Comparação de aptâmeros modificados (NAM) e não modificados (DNA). Os aptâmeros obtidos na atividade 1 serão caracterizados tendo em conta estabilidade, afinidade e seletividade. Estes dados serão comparados com as propriedades de aptâmeros de DNA. Serão desenvolvidos modelos que facilitem a comparação das características de aptâmeros de NAM e DNA.

• Atividade 3 – Desenvolvimento de um ensaio portátil tipo em aptâmeros. Com base na caracterização da atividade 2, os aptâmeros mais promissores serão incorporados num teste portátil. O ensaio será avaliado tendo em conta a especificidade e limite de deteção. No final desta atividade, o teste portátil estará pronto para validação com amostras alimentares.

• Atividade 4 – Validação do ensaio portátil em matrizes alimentares. O ensaio portátil será validado utilizando amostras de alimentos. Os resultados obtidos serão comparados com as técnicas padrão.