PeXPTPrionGoat - Prevenção de futuros focos de EET: Explorando a diversidade do gene codificante da proteína do prião para resistência em caprinos portugueses

Objetivo principal

1. Definir a frequência dos polimorfismos do gene da proteína priónica (prnp) nas raças portuguesas e raças exóticas mais utilizadas;
2. Estimar estes polimorfismos na população caprina em geral;
3. Identificar raças de caprinos criadas em Portugal resistentes ao tremor epizoótico (TE);
4. Determinar o genótipo completo prnp nos casos caprinos de TE.

O conhecimento mais profundo destes aspetos poderá responder a muitas das questões ainda em aberto no que concerne às encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs), doenças neurodegenerativas progressivas e fatais. Estes novos dados, que serão divulgados no âmbito de uma plataforma de trabalho colaborativa, serão imprescindíveis para o delineamento de programas de seleção genética para a resistência às EETs, de importância fundamental para o controlo destas afeções.

Objetivos, atividades e resultados esperados

Tarefa 1: Colheita de amostras e extração de DNA genómico caprino (INIAV/DGAV/EURL-TSEs)
Para definir a frequência dos alelos do gene da proteína priónica (prnp) em Portugal, pretendemos analisar todas as raças caprinas nativas portuguesas e exóticas mais utilizadas em Portugal, bem como uma amostra de animais negativos para EETs da população caprina em geral e rebanhos afetados por tremor epizoótico (TE). Todos os casos de TE em caprinos detetados no nosso país (n = 23) serão também genotipados através da sequência de toda a sequência codificante do prnp. Nas raças puras, o ADN será extraído do sangue; em caso de EET negativo será utilizado tecido do tronco cerebral ou do pavilhão auricular dos caprinos. Nos rebanhos afetados por TE, o sangue será recolhido em animais vivos e do tronco cerebral ou do pavilhão auricular em caprinos encontrados mortos na exploração. Existem 352 000 cabras em Portugal, representando o sexto país da União Europeia em termos de população caprina Eurostat: (https://ec.europa.eu/eurostat/statistics-explained/index.php?oldid=427096#Livestock_population).

Resultados esperados: [1] Detetar mutações/polimorfismos com um nível de confiança de 95% quando atingem uma frequência mínima de 3,6%; [2] Estimar a proporção de cada polimorfismo detetado com uma precisão na gama de 7-11%, dependendo dos diferentes cenários (respetivamente se as mutações variarão entre 3,6% a 50%). O DNA de alguns caprinos já está disponível no Banco Português de Germoplasma Animal, sediado no INIAV. Para garantir a representatividade, aplicaremos uma estratégia de amostragem semelhante à utilizada em Torricelli et al., 2021, considerando a dimensão da exploração e tentando apanhar, proporcionalmente, a mesma percentagem de animais em todas as explorações.

Tarefa 2: Determinação de genótipos prnp na população caprina nacional e casos positivos de EET
Nesta tarefa iremos realizar a sequenciação de todo o gene prnp no DNA extraído na Tarefa 1. As amostras serão submetidas a PCR com primers específicos para prnp de acordo com Van Poucke et al. (24). Após confirmação do sucesso da amplificação por eletroforese em gel de agarose (BIO_RAD), o produto de PCR será purificado com Exo-Sap (ExoSap-IT; USP Corporation, #78201) de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos e primers obtidos serão enviados para sequenciação bidirecional para um serviço de sequenciação externo. As sequências de nucleótidos obtidas serão editadas e alinhadas com prnp caprino utilizando um software adequado para a obtenção de sequências de consenso para cada amostra. Para identificar picos heterozigotos, serão adicionalmente verificados eletroferogramas em cada ponto de mutação investigado. A análise estatística está descrita na tarefa 4.
Após a identificação da localização da mutação, iremos compará-las com as mutações já descritas e procurar possíveis novas.
Os dados obtidos nesta Tarefa permitirão o desenvolvimento de um método baseado em PCR (Tarefa 3), baseado na metodologia de extensão de primers para identificar os SNPs relevantes.

Resultados esperados: Esperamos determinar a frequência dos alelos já reportados na população caprina em Portugal e, eventualmente, identificar novas mutações específicas do efetivo caprino nacional, representado por 6 raças caprinas nativas e 3 exóticas e também em todos os casos de tremor epizoótico caprino detetados em Portugal até ao momento. A natureza e localização das variantes serão identificadas. Estes resultados permitirão, em primeiro lugar, verificar se existe uma correspondência entre os alelos reportados por diferentes autores em todo o mundo e as nossas raças caprinas nativas. Com estes dados, poderemos implementar novos ensaios multiplex (Tarefa 3), de forma a identificar as mutações prnp relevantes detetadas, de forma simultânea, rápida e eficaz.

Tarefa 3: Implementação de uma metodologia rápida para a genotipagem de prnp
Após a extração do DNA genómico, dois fragmentos (acesso à sequência de referência: #X74758 e #GQ267530.1), incluindo as mutações do SNP alvo no prnp, serão amplificados por PCR utilizando um par de iniciadores adequadamente desenhados. A amplificação será confirmada por eletroforese em gel de agarose e os produtos de PCR serão purificados com Exo-Sap. Posteriormente, será utilizado um sistema SNaPshot Multiplex customizado (Snapshot; Applied Biosystems, #4323154) semelhante ao previamente implementado pela nossa equipa para a genotipagem de prnp de ovinos, e atualmente em utilização no Laboratório de Genética Molecular (LGM, INIAV). Assim, será realizada uma segunda PCR com primers específicos desenhados de acordo com as sequências de referência prnp de cabra do GeneBank identificadas acima, para hibridizar antes de cada posição polimórfica, correspondentes aos códons 127, 142, 143, 146, 154, 211, 222 em prnp. Este procedimento permitirá a inclusão de novas mutações eventualmente detetadas (Tarefa 2).
Os produtos de PCR são fragmentos fluorescentes de 30-60 pb, resultantes da extensão do primer de um ddNTP marcado com fluorescência de base única que deve ser novamente purificado com SAP para remover os ddNTPs não incorporados. Após desnaturação térmica, estes fragmentos serão submetidos a eletroforese capilar (analisador genético ABI3130) com tamanho padrão interno (120 LIZ). O resultado desta análise será interpretado com o software GeneMapper (Applied Biosystems), permitindo a identificação de SNPs.

Resultados esperados: Espera-se implementar uma metodologia rápida e fiável baseada em PCR para detetar simultaneamente o polimorfismo de nucleótido único (SNP´s) previamente identificado (Tarefa 2) no prnp caprino português utilizando um procedimento de extensão de primers. Esta metodologia estará disponível para futuras genotipagens de raças caprinas.

Tarefa 4: Análise estatística de dados e definição de supostos grupos caprinos de risco para tremor epizoótico clássico e atípico
As sequências obtidas a partir da Task2 serão alinhadas entre si, e com as de outras sequências genéticas recuperadas das bases de dados GenBank utilizando o programa Clustal W (Ver.1.83), e DnaSP, DNA - para a análise de polimorfismo de nucleótidos a partir de dados de sequências de DNA alinhadas. A análise filogenética será realizada através dos métodos de junção de vizinhos (NJ) e de máxima parcimónia (MP). A árvore filogenética será desenhada com o TreeView 68 K.
O software GeneMapper será utilizado para a determinação de alelos. Os parâmetros de diversidade genética serão estimados utilizando programas de software adequados (por exemplo, Genalex, GDA ou Genetix). A diversidade genética será quantificada: Taxa de polimorfismo (Pj); Proporção de lociRicheza polimórfica das variantes alélicas (A), Número médio de alelos por locus; Heterozigosidade média esperada (He). A diferenciação populacional será estimada com base na estatística F ou em métodos bayesianos com software Structure. Os desvios do equilíbrio de Hardy Weinberg (HWE) das frequências genotípicas em cada locus ou combinação populacional serão avaliados por análise de qui-quadrado e/ou por outras abordagens disponíveis, nomeadamente pelo software Genepop.
Para comparar com estudos anteriores noutras raças caprinas, os alelos prnp mais prováveis serão calculados nas frequências alélicas observadas nas populações/raças objeto deste estudo, com base na inferência estatística e em eventos probabilísticos. Além disso, as distâncias genéticas entre as raças estudadas serão estimadas com base nas frequências alélicas prnp.

Resultados esperados: Através de uma análise integrada de todos os dados obtidos, pretendemos:

1. identificar frequências genotípicas prnp na população caprina portuguesa;
2. determinar os genótipos completos do prnp dos caprinos afetados pelo TE;
3. definir grupos de risco putativos em caprinos tanto para o TE clássico como para o TE atípico.

Tarefa 5: Divulgação dos resultados e criação de uma plataforma de trabalho colaborativo e de uma base de dados sobre EET em caprinos.
Os resultados e os dados obtidos neste projeto, assegurando princípios de proteção de dados, serão incluídos na já estabelecida plataforma online gerida pelo INIAV, dedicada aos animais domésticos de Portugal – a rede temática AniDop(https://anidop.iniav.pt/index.php) em estreita ligação com o Centro de Competências de Caprinicultura (CCC (http://www.caprinicultura.pt) de forma a estar disponível aos principais intervenientes como as associações nacionais de criadores, a Sociedade Portuguesa de Ovinotecnia e Caprinotecnia e a “Sociedade Portuguesa de Recursos Genéticos Animais”, bem como a nossa instituição colaboradora - DGAV, Autoridade Veterinária Nacional.
Este CCC tem como missão promover o desenvolvimento e a sustentabilidade da indústria caprina em Portugal, através do reforço da investigação, da promoção da inovação e de boas práticas na produção de caprinos e da transferência e difusão de conhecimento. Este projeto irá fornecer novos dados sobre a população caprina nacional, que são importantes para o controlo das EET, com aplicabilidade e divulgação adequadas nesta plataforma colaborativa no interesse da produção caprina nacional. Através da outra Instituição Colaborativa-EURL-TSE, este projeto obterá uma internacionalização que será alargada a outros grupos de investigação internacionais que trabalham nesta temática para partilhar os resultados obtidos e contribuir para enriquecer o conhecimento da EET em caprinos.

Para além disso, propomos também a divulgação dos resultados em revistas científicas internacionais e nacionais, através de comunicações em encontros internacionais e nacionais e através da organização de seminários/conferências.

Resultados esperados: Divulgação Nacional e Internacional dos dados